人巨噬細(xì)胞刺激蛋白ELISA檢測(cè)試劑盒實(shí)驗(yàn)原理
發(fā)表時(shí)間：2025-05-14
人巨噬細(xì)胞刺激蛋白（MSP）ELISA檢測(cè)試劑盒的實(shí)驗(yàn)原理基于雙抗體夾心法，通過(guò)特異性抗體對(duì)目標(biāo)蛋白的高效捕獲與檢測(cè)實(shí)現(xiàn)定量分析。以下是實(shí)驗(yàn)過(guò)程的詳細(xì)展開(kāi)：
**1. 樣本預(yù)處理與加樣**
待測(cè)樣本（血清、血漿或細(xì)胞培養(yǎng)上清）需經(jīng)離心去除雜質(zhì)，避免纖維蛋白原干擾。稀釋后的樣本與標(biāo)準(zhǔn)品同步加入預(yù)包被抗MSP單克隆抗體的微孔板中，37℃孵育1小時(shí)，抗體通過(guò)疏水作用與板壁牢固結(jié)合，形成固相免疫復(fù)合物。
**2. 洗滌與酶標(biāo)抗體結(jié)合**
洗板機(jī)采用8道垂直沖洗，去除未結(jié)合蛋白后，加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗。該抗體針對(duì)MSP的不同表位設(shè)計(jì)，與捕獲抗體構(gòu)成"三明治"結(jié)構(gòu)，確保檢測(cè)特異性。45分鐘溫育過(guò)程中，酶標(biāo)抗體與目標(biāo)蛋白的濃度梯度呈正相關(guān)。
**3. 顯色反應(yīng)與終止**
TMB底物在HRP催化下發(fā)生氧化還原反應(yīng)，生成藍(lán)色產(chǎn)物。反應(yīng)10分鐘后，硫酸終止液使溶液轉(zhuǎn)為黃色，此時(shí)450nm波長(zhǎng)處的吸光度值與MSP濃度成正比。關(guān)鍵控制點(diǎn)包括：顯色時(shí)間需精確至±15秒，避免強(qiáng)光直射導(dǎo)致底物降解。
**4. 數(shù)據(jù)分析與質(zhì)量控制**
酶標(biāo)儀自動(dòng)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（通常R2≥0.99），未知樣本濃度通過(guò)四參數(shù)擬合計(jì)算。每板應(yīng)設(shè)置空白孔（僅緩沖液）、陰性對(duì)照（不含MSP樣本）及復(fù)孔（CV＜10%）。異常值需結(jié)合樣本稀釋線性（80%-120%回收率為合格）判斷是否重測(cè)。
**注意事項(xiàng)**
? 溶血樣本會(huì)釋放血紅素抑制HRP活性，需重新采集
? 板條開(kāi)封后需密封防潮，避免抗體效價(jià)下降
? 冬季實(shí)驗(yàn)時(shí)建議預(yù)熱洗液至25℃，防止洗滌不徹底
該技術(shù)可檢測(cè)低至15pg/mL的MSP，為研究巨噬細(xì)胞活化機(jī)制及炎癥性疾病提供精準(zhǔn)工具。后續(xù)實(shí)驗(yàn)可結(jié)合Western Blot驗(yàn)證，或通過(guò)阻斷實(shí)驗(yàn)確認(rèn)抗體特異性。
